Përdorimi dhe masat paraprake të tubit të centrifugës së ultrafiltrimit
1) Zgjidhni një tub ultrafiltrimi të përshtatshëm.Vini re se membranat UF ndryshojnë në nivelin e tyre të tolerancës ndaj kimikateve të ndryshme.Në mënyrë tipike, tubat e ultrafiltrimit me një ndërprerje të peshës molekulare 10 kDa mund të zgjidhen me një ndërprerje të peshës molekulare që nuk duhet të jetë më e madhe se 1/3 e peshës molekulare të proteinës së interesit, si p.sh. 35 kDa.Nëse pesha molekulare e proteinës së interesit është rreth 10 kd, mund të përdoret një tub ultrafiltrimi me një prerje të peshës molekulare prej 3 KD.
(2) Ultrafiltrimi, i sapo blerë, është i thatë, me ujë ultra të pastër të shtuar përpara përdorimit dhe uji i kaluar plotësisht përmes membranës, banjës së akullit ose frigoriferit të ftohur paraprakisht për disa minuta.Më pas derdhet uji, dmth. lëngu i proteinës dhe sa shtohet, cilado që të mos jetë më shumë se vija e bardhë në pjesën e sipërme të tubit.Operacioni është i lehtë dhe tubi i ultrafiltrimit duhet të ftohet paraprakisht në akull përpara se të shtohet solucioni proteinik.
3) Si masa ashtu edhe qendra e gravitetit duhej të arrinin ekuilibrin.Vini re se shpejtësia e rrotullimit dhe nxitimi nuk janë shumë të shpejta, përndryshe dëmtojnë drejtpërdrejt membranën e ultrafiltrimit.Filloi ultrafiltrimi centrifugal (centrifuga e ftohur paraprakisht në 4 gradë).Pasi RPM e centrifugave të ndryshme u konvertua në g, ishte ndryshe.Përshpejtimi i centrifugës u rregullua në minimum, duke ulur presionin në membranë.Shënim, sigurohuni që të largoheni nga centrifuga pasi centrifuga të ketë arritur shpejtësinë e saj të destinacionit, ose nëse keni një problem, nuk mund ta trajtoni atë për herë të parë.Orientimi i membranës në bosht u rregullua sipas udhëzimeve (rasti i centrifugës këndore është pingul nga membrana me boshtin).Në përdorim praktik, shpejtësia e përgjithshme e rrotullimit është më e ulët se ajo në udhëzime, kështu që jeta e tubit të centrifugës mund të zgjatet.
3) Si masa ashtu edhe qendra e gravitetit duhej të arrinin ekuilibrin.Vini re se shpejtësia e rrotullimit dhe nxitimi nuk janë shumë të shpejta, përndryshe dëmtojnë drejtpërdrejt membranën e ultrafiltrimit.Filloi ultrafiltrimi centrifugal (centrifuga e ftohur paraprakisht në 4 gradë).Pasi RPM e centrifugave të ndryshme u konvertua në g, ishte ndryshe.Përshpejtimi i centrifugës u rregullua në minimum, duke ulur presionin në membranë.Shënim, sigurohuni që të largoheni nga centrifuga pasi centrifuga të ketë arritur shpejtësinë e destinacionit, ose nëse keni një problem, nuk mund ta trajtoni atë për herë të parë.Orientimi i membranës në bosht u rregullua sipas udhëzimeve (rasti i centrifugës këndore është pingul nga membrana me boshtin).Në përdorim praktik, shpejtësia e përgjithshme e rrotullimit është më e ulët se ajo në udhëzime, kështu që jeta e tubit të centrifugës mund të zgjatet.
(4) Kur përqendrohet në 1 ml të mbetur, merrni 50 ul tretësirë tampon, shtoni 10 ul rrjedhje dhe shikoni nëse ka ndonjë ngjyrë blu, si një gjykim nëse tubit të ultrafiltrimit i mungon proteina.Nëse tubi rrjedh, derdhni përsëri shtresën e sipërme dhe derdhni në një tub të ri për të filluar ultrafiltrimin.Për të përcaktuar me saktësi nëse tubat nuk kanë munguar, centrifugoni për 10 minuta me 5mgml BSA përpara rrjedhës, duke përdorur ngjitësin proteinik ose analizën bruto Bradford dhe vazhdoni duke shtuar tretësirën e mbetur të proteinës së koncentruar (e cila vepron në akull dhe parandalon proteinat të nxehen) derisa i gjithë koncentrati është shtuar.Kini kujdes gjatë centrifugimit nëse ndodh precipitimi i proteinave, duke çuar në mbylljen e tubit.Nëse ndodh reshje, përcaktoni nëse shkaku specifik i reshjeve është një përqendrim i tepërt i proteinave ose një tampon i papërshtatshëm;E para mund të zgjidhet me ultrafiltrim të tubave të shumëfishtë ultrafiltrues njëkohësisht, duke ulur përqendrimin, dhe e dyta duke shkëmbyer zgjidhje të ndryshme tampon derisa të mos ndodhë precipitimi i proteinës.
(4) Kur përqendrohet në 1 ml të mbetur, merrni 50 ul tretësirë tampon, shtoni 10 ul rrjedhje dhe shikoni nëse ka ndonjë ngjyrë blu, si një gjykim nëse tubit të ultrafiltrimit i mungon proteina.Nëse tubi rrjedh, derdhni përsëri shtresën e sipërme dhe derdhni në një tub të ri për të filluar ultrafiltrimin.Për të përcaktuar me saktësi nëse tubat nuk kanë munguar, centrifugoni për 10 minuta me 5mgml BSA përpara rrjedhës, duke përdorur ngjitësin proteinik ose analizën bruto Bradford dhe vazhdoni duke shtuar tretësirën e mbetur të proteinës së koncentruar (e cila vepron në akull dhe parandalon proteinat të nxehen) derisa i gjithë koncentrati është shtuar.Kini kujdes gjatë centrifugimit nëse ndodh precipitimi i proteinave, duke çuar në mbylljen e tubit.Nëse ndodh reshje, përcaktoni nëse shkaku specifik i reshjeve është një përqendrim i tepërt i proteinave ose një tampon i papërshtatshëm;E para mund të zgjidhet me ultrafiltrim të tubave të shumëfishtë ultrafiltrues njëkohësisht, duke ulur përqendrimin, dhe e dyta duke shkëmbyer zgjidhje të ndryshme tampon derisa të mos ndodhë precipitimi i proteinës.
(5) Hapat e parë përdoren për të përqendruar proteinën dhe nëse buferi duhet të ndryshohet, shtoni butësisht tampon të ri (ultrafiltrim përmes një membrane ultrafiltrimi 0.22um) në rreth 1 ml proteinë totale dhe rikoncentrohuni në rreth 1 ml për tre. herë radhazi, me vëllimin përfundimtar të përqendruar përfundimtar në varësi të përqendrimit të proteinës së dëshiruar, përgjithësisht jo më shumë se 500ul, por edhe brenda 200ul.Arritni 1000 × ose më shumë në tre raste, në thelb po aq ndryshim buferi, siç llogaritet nga të paktën 10 × ose më shumë pasurim vëllimi çdo herë.
(5) Hapat e parë përdoren për të përqendruar proteinën dhe nëse buferi duhet të ndryshohet, shtoni butësisht tampon të ri (ultrafiltrim përmes një membrane ultrafiltrimi 0.22um) në rreth 1 ml proteinë totale dhe rikoncentrohuni në rreth 1 ml për tre. herë radhazi, me vëllimin përfundimtar të përqendruar përfundimtar në varësi të përqendrimit të proteinës së dëshiruar, përgjithësisht jo më shumë se 500ul, por edhe brenda 200ul.Arritni 1000 × ose më shumë në tre raste, në thelb po aq ndryshim buferi, siç llogaritet nga të paktën 10 × ose më shumë pasurim vëllimi çdo herë.
Koha e postimit: Nëntor-09-2022