PCR, është reaksioni zinxhir i polimerazës, i cili i referohet shtimit të dNTP, Mg2+, faktorëve të zgjatjes dhe faktorëve të rritjes së amplifikimit në sistem nën katalizimin e ADN polimerazës, duke përdorur ADN-në mëmë si shabllon dhe abetare specifike si pikënisje të shtrirjes. Nëpërmjet hapave të denatyrimit, pjekjes, shtrirjes, etj., procesi i replikimit in vitro të ADN-së së vargut të bijës, komplementar me shabllonin e ADN-së së vargut mëmë, mund të amplifikojë shpejt dhe në mënyrë specifike çdo ADN të synuar in vitro.
1. Hot Start PCR
Koha e fillimit të amplifikimit në PCR konvencionale nuk është që të vendosni makinën PCR në makinën PCR, dhe më pas programi fillon të amplifikohet.Kur përfundon konfigurimi i sistemit, fillon amplifikimi, i cili mund të shkaktojë përforcim jospecifik dhe PCR me fillimin e nxehtë mund ta zgjidhë këtë problem.
Çfarë është PCR me start hot?Pasi të përgatitet sistemi i reaksionit, modifikuesi i enzimës lëshohet në temperaturë të lartë (zakonisht më e lartë se 90°C) gjatë fazës fillestare të ngrohjes të reaksionit ose fazës së "fillimit të nxehtë", në mënyrë që polimeraza e ADN-së të aktivizohet.Koha dhe temperatura e saktë e aktivizimit varen nga natyra e polimerazës së ADN-së dhe modifikuesit të fillimit të nxehtë.Kjo metodë përdor kryesisht modifikues të tillë si antitrupat, ligandët e afinitetit ose modifikuesit kimikë për të penguar aktivitetin e polimerazës së ADN-së.Meqenëse aktiviteti i ADN polimerazës frenohet në temperaturën e dhomës, teknologjia e fillimit të nxehtë ofron lehtësi të madhe për përgatitjen e sistemeve të shumta të reagimit PCR në temperaturën e dhomës pa sakrifikuar specifikën e reaksioneve PCR.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) është një teknikë eksperimentale për transkriptimin e kundërt nga mRNA në cDNA dhe duke e përdorur atë si një shabllon për amplifikimi.Procedura eksperimentale është të nxirret së pari ARN totale në inde ose qeliza, të përdoret Oligo (dT) si një primer, përdorimi i transkriptazës së kundërt për të sintetizuar cDNA dhe më pas përdorimi i cDNA si shabllon për amplifikimin e PCR për të marrë gjenin e synuar ose për të zbuluar shprehjen e gjenit.
3. PCR sasiore fluoreshente
PCR sasiore fluoreshente (PCR sasiore në kohë reale,RT-qPCR) i referohet metodës së shtimit të grupeve fluoreshente në sistemin e reagimit PCR, duke përdorur akumulimin e sinjaleve fluoreshente për të monitoruar të gjithë procesin e PCR në kohë reale, dhe në fund duke përdorur kurbën standarde për të analizuar në mënyrë sasiore shabllonin.Metodat qPCR të përdorura zakonisht përfshijnë SYBR Green I dhe TaqMan.
4. Nested PCR
Nested PCR i referohet përdorimit të dy grupeve të primerëve PCR për dy raunde të amplifikimit PCR, dhe produkti i amplifikimit të raundit të dytë është fragmenti i gjenit të synuar.
Nëse një mospërputhje e çiftit të parë të abetareve (primerëve të jashtëm) shkakton përforcimin e një produkti jospecifik, mundësia që i njëjti rajon jo specifik të njihet nga çifti i dytë i primerëve dhe të vazhdojë të amplifikohet është shumë i vogël, kështu që amplifikimi nga çifti i dytë i primerëve, specifika e PCR është përmirësuar.Një avantazh i kryerjes së dy raundeve të PCR është se ndihmon në përforcimin e produktit të mjaftueshëm nga ADN-ja fillestare e kufizuar.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR është një metodë për të përmirësuar specifikën e reaksionit PCR duke rregulluar parametrat e ciklit PCR.
Në touchdown PCR, temperatura e pjekjes për ciklet e para vendoset disa gradë mbi temperaturën maksimale të pjekjes (Tm) të primerëve.Temperatura më e lartë e pjekjes mund të zvogëlojë në mënyrë efektive amplifikimin jo specifik, por në të njëjtën kohë, temperatura më e lartë e pjekjes do të përkeqësojë ndarjen e primerëve dhe sekuencave të synuara, duke rezultuar në rendimentin e reduktuar të PCR.Prandaj, në ciklet e para, temperatura e pjekjes zakonisht vendoset të ulet me 1°C për cikël për të rritur përmbajtjen e gjenit të synuar në sistem.Kur temperatura e pjekjes ulet në temperaturën optimale, temperatura e pjekjes mbahet për ciklet e mbetura.
6. PCR direkte
PCR direkte i referohet amplifikimit të ADN-së së synuar drejtpërdrejt nga kampioni pa pasur nevojë për izolim dhe pastrim të acidit nukleik.
Ekzistojnë dy lloje të PCR direkte:
metoda direkte: merrni një sasi të vogël kampioni dhe shtoni direkt në PCR Master Mix për identifikimin e PCR;
metoda e plasaritjes: pas marrjes së kampionit, shtoni atë në lizatë, lizoni për të çliruar gjenomin, merrni një sasi të vogël të supernatantit të lizuar dhe shtoni atë në PCR Master Mix, kryeni identifikimin PCR.Kjo qasje thjeshton rrjedhën e punës eksperimentale, zvogëlon kohën e përdorimit dhe shmang humbjen e ADN-së gjatë hapave të pastrimit.
7. NSH PCR
Ndarja e gjeneve me shtrirje të mbivendosjes PCR (SOE PCR) përdor primerë me skaje plotësuese për të bërë që produktet e PCR të formojnë zinxhirë të mbivendosur, kështu që në reaksionin e mëpasshëm të amplifikimit, përmes shtrirjes së zinxhirëve të mbivendosur, burime të ndryshme të teknikës A në të cilën fragmentet e përforcuara mbivendosen. dhe të bashkuara së bashku.Kjo teknologji aktualisht ka dy drejtime kryesore aplikimi: ndërtimi i gjeneve të shkrirjes;mutacion i drejtuar nga vendi i gjenit.
8. IPCR
PCR inverse (IPCR) përdor primerë plotësues të kundërt për të përforcuar fragmente të ADN-së të ndryshme nga dy primerët, dhe amplifikon sekuenca të panjohura në të dy anët e një fragmenti të njohur të ADN-së.
IPCR fillimisht u krijua për të përcaktuar sekuencën e rajoneve të panjohura ngjitur, dhe përdoret kryesisht për të studiuar sekuencat e promotorëve të gjeneve;rirregullimet kromozomale onkogjene, të tilla si shkrirja, translokimi dhe transpozimi i gjeneve;dhe integrimi i gjenit viral, përdoren gjithashtu zakonisht tani Për mutagjenezën e drejtuar nga vendi, kopjoni një plazmid me mutacionin e dëshiruar.
9. dPCR
PCR dixhitale (dPCR) është një teknikë për përcaktimin e sasisë absolute të molekulave të acidit nukleik.
Aktualisht ekzistojnë tre metoda për përcaktimin sasior të molekulave të acidit nukleik.Fotometria bazohet në absorbimin e molekulave të acidit nukleik;PCR sasiore fluoreshente në kohë reale (PCR në kohë reale) bazohet në vlerën Ct dhe vlera Ct i referohet numrit të ciklit që korrespondon me vlerën e fluoreshencës që mund të zbulohet;PCR dixhitale është teknologjia më e fundit sasiore e bazuar në metodën PCR me një molekulë për numërimin e sasisë së acidit nukleik, është një metodë sasiore absolute.
Koha e postimit: Qershor-13-2023